在细胞培养中,良好的实验规范和定期检测支原体污染也十分必要。支原体检测的方法有很多种,如直接培养、DNA 荧光染色、ELISA和PCR法等。本产品主要采用PCR方法对各种生物材料(如细胞培养物、实验动物分泌物、动物血清等)支原体感染的检测。通过PCR方法检测培养细胞等生物材料中的支原体,所用引物为根据支原体16S-23S rRNA序列保守区域设计,只特异性扩增支原体 DNA,检出灵敏度与特异性均较高。PCR扩增及电泳分析只需数个小时,操作方便简单。
产品成分
组分编号 | 组分名称 | 规格 | 储存条件 |
-A | Green Taq Mix | 250µl | -20℃ |
-B | ddH2O | 250µl |
-C | Positive Control Template | 50µl |
-D | Primers | 50µl |
使用说明
(请详细阅读使用说明后再开始相关实验)
1.待测细胞连续传代3次或培养至两周;
2.细胞达到80% confluency或以上的时候,取1ml上清,进行低速离心(300g,5min,4℃);
3.离心结束后取950μl上清液,转移至新的无菌EP管中,以去除培养基中的细胞;
4.将上清液高速离心(12000g,10min,4℃),离心结束后,去除900μl上清,剩余50ul用以重悬沉淀(可能肉眼不可见);
5.将重悬好的沉淀放置4度冰箱,作为PCR的模板备用;
根据下表,配制PCR反应液
试剂 | 实验组 | 阳性对照 | 阴性对照 |
A | 12.5µl | 12.5µl | 12.5µl |
待测样品 | 5µl |
|
|
C |
| 5µl |
|
B | 5.5µl | 5.5µl | 10.5µl |
D | 2µl | 2µl | 2µl |
注:为防止Positive Control Template 污染,请将实验组和阴性对照组加完以后,最后再将C液加入阳性对照组
6.PCR程序
步骤 | 温度 | 反应时间 | 循环数 |
Step 1 | 95℃ | 5min | 1 |
Step 2 | 94℃ | 30s | 5 |
50℃ | 30s |
72℃ | 35s |
Step 3 | 94℃ | 15s | 23 |
56℃ | 15s |
72℃ | 30s |
Hold | 12℃ | ∞ |
|
7.制备DNA gel:称取一定量Argrose粉末,用1X TAE buffer配制成1.5%的DNA GEL;
8.待PCR反应结束后,取8-10μl的PCR 反应液(无需要加 loading buffer)直接进行1.5%琼脂糖凝胶电泳,确认PCR扩增产物;
9.目的条带为518bp。示例如下:

推荐使用频率
新细胞进入实验室 | 必检 |
液氮保存前 | 必检 |
定期常规 | 每月一次 |
发现污染后 | 每周一次 |
发现细胞异常 | 随时检测 |