本试剂盒能够快速、简便、高效地对基于HIV-1构建的慢病毒进行有效滴度测定。通过对感染慢病毒的细胞基因组DNA中整合的慢病毒插入片段拷贝数进行Q-PCR测定，计算出初始病毒的有效滴度。
产品成分
试剂名称 | 内容 | 数量 |
Solution 1 | 标准品DNA模板（5x10^9 c/μl） | 100μl |
Solution 2 | Lenti-primer (10μM) | 40μl |
Solution 3 | Lenti-probe –FAM/TAMRA(2.5μM) | 80μl |
Solution 4 | Taq (probe qPCR) (2X) | 1ml |
Solution 5 | ROXI(50X) | 40μl |
Solution 6 | ROX II(50X) | 80μl |
其他所需材料
细胞基因组DNA抽提试剂（离心柱法）
超纯水
Q-PCR用96孔板或8连管
定量PCR仪
1.5ml无酶离心管用于样品制备
无酶枪尖
操作步骤
1.取感染72h后的293T细胞，胰酶消化制备单细胞悬液，细胞计数，得细胞数为N;
2.利用细胞基因组抽提试剂盒提取293T细胞基因组DNA，测定基因组DNA总量为G (μg)，稀释至50ng/μl备用；
注：此步骤推荐使用分离柱式基因组抽提试剂盒
3.根据下表稀释标准品及基因组DNA样品：
| 标准品管 | 样品管 |
| # | 稀释倍数 | Water | 标准品 | 拷贝数/μl | 稀释倍数 | Water | 样品(50ng/μl) |
| 1 | 10^1 | 45μl | 5μl | 5.45x10^8 | 10 | 45μl | 5μl |
| 2 | 10^2 | 45μl | 5μl of 1# | 5.45x10^7 | 50 | 40μl | 10μl of #1 |
| 3 | 10^3 | 45μl | 5μl of 2# | 5.45x10^6 | 100 | 45 | 5μl of #1 |
| 4 | 10^4 | 45μl | 5μl of 3# | 5.45x10^5 |
|
| 5 | 10^5 | 45μl | 5μl of 4# | 5.45x10^4 |
| 6 | 10^6 | 45μl | 5μl of 5# | 5.45x10^3 |
梯度稀释取样前，需充分混匀；
4.根据下表配制反应液，每组配制3个复孔：
试剂 | 用量 | 终浓度 |
标准品或样本 | 2μl | *1 |
Lenti-primer (10μM) | 0.4μl | 0.2μM |
Lenti-probe (2.5μM) | 0.8μl | 0.1μM |
Taq (probe qPCR) (2X) | 10μl | 1X |
ROX | *2 |
|
Water | 补至20μl |
|
*1：样本除步骤3中稀释的3种浓度外，另需一组未稀释样本，即总量为100ng/孔；另需设置阴性对照孔，即不添加任何DNA模板；
*2：根据所使用仪器添加：
| 适用仪器 |
ROX I (终浓度1X) | 7300 Real-Time PCR System/ StepOnePlus Real-Time PCR System |
ROX II (终浓度0.5X) | 7500 Real-Time PCR System/7500 Fast Real-Time PCR System |
无需ROX | Thermal Cycler Dice Real Time System series/ LightCycler 480 System/ CFX96 Real-Time PCR Detection System |
5.上机，按照以下程序进行Q-PCR反应：
变性 (1 Cycle)：95℃ 30s
扩增 (40 cycles)：95℃ 5s + 60℃ 30s
注：可根据具体使用仪器自行调整程序。
6.计算标准曲线：计算每组标准品的平均Ct值，以平均Ct值为X，Loge(copy number)为Y，生成标准曲线Y=A*Ct+B。标准曲线R2需大于0.99；
7.计算样本平均Ct值，带入标准曲线计算出copy number=n。
注：以Ct值在标准曲线范围内的数据为准，若样本Ct值超过或低于标准曲线Ct值，需对样本稀释倍数进行相应调整。
8.计算病毒滴度：举例
Titer(TU/ml)=[n*d*(G/0.1)/N]*Nori/V
其中：n=步骤7中计算所得拷贝数；d=所用Ct值对应的稀释倍数(1, 10, 50, 100)；G=基因组提取所得DNA总量(μg)；N=基因组提取所用细胞数；Nori=病毒感染时细胞数；V=病毒感染时病毒用量(ml)。
计算各个Ct值位于标准曲线范围内的不同稀释倍数组病毒滴度，取平均值为最终结果。
