小鼠CD11b+cDC2树突状细胞培养试剂盒

小鼠CD11b+cDC2树突状细胞培养试剂盒是为在体外培养和诱导小鼠造血前体细胞向成熟CD11b+cDC2树突状细胞（DC）亚群分化发育而专门设计的一款含血清培养基套装。

产品成分

其他本试剂盒未提供但需用的重要试剂

小鼠 c-kit+ 造血前体细胞磁珠分选试剂

完全培养基配制

（在无菌生物安全柜中，开展以下操作）

   1.在4℃冰箱解冻补充因子和胎牛血清，混匀后使用。

注：解冻后的补充因子和血清可放置于4℃冰箱，在1个月内使用；或者分装至合适体积后，保存于-20℃冰箱，不可反复冻融！

   2.扩增培养基配制：将1体积的扩增补充因子和10体积的血清加入到89体积的基础培养基中，充分混匀，得到小鼠cDC2树突状细胞扩增培养基。如取100ul补充因子和1ml血清加入至8.9ml基础培养基，以此类推。

   分化培养基配制：将1体积的分化补充因子和10体积的血清加入到89体积的基础培养基中，充分混匀，得到小鼠cDC2树突状细胞分化培养基。

注：配好的完全培养基请于4℃保存，且于1个月内使用完毕。

使用说明

（请详细阅读使用说明后再开始相关实验）

   1.使用淋巴细胞分离液从小鼠骨髓总细胞中分离得到骨髓单个核细胞（BM-MNC），计数。

   2.使用磁珠分选BM-MNC中c-kit+造血前体细胞（参考所使用试剂盒的说明书），计数。

注：一只小鼠骨髓中约含有1.5*10^6 c-kit+造血前体细胞，可根据需要调整进入分选的BM-MNC细胞量。

   3.D0：使用扩增培养基重悬BM-MNC，调整细胞密度至2.5*10^4/ml，按照如下表格所示将细胞铺于培养板：

   5.D3：扩孔。轻轻吹打孔内细胞及培养基，按照1:3将原孔内悬浮细胞平均分至3个新孔中，同时补加新鲜扩增培养基至初始培养体积（步骤3表格）。

注：完全培养基请恢复至室温后使用，减少对细胞的刺激；

   6.D6：1)扩孔：轻轻吹打孔内细胞及培养基，按照1:2将原孔内悬浮细胞平均分至2个新孔中；

       2)诱导分化：在每个新孔内，补加等量分化培养基；

注：由于培养过程中培养基的挥发造成体积损失，该步骤加入分化培养基时可按照24孔板每孔加入0.5ml或6孔板每孔加入2ml分化培养基计算。D6时培养板底会有一定量贴壁细胞出现，扩孔时请轻轻吹打细胞，只将悬浮细胞转移至新孔。贴壁细胞多为巨噬细胞，会影响最终DC纯度。

   7.D8：1)小心贴培养板侧壁用枪尖吸走1/2体积旧培养基；

       2)转孔：轻轻吹打细胞，收集悬浮细胞，按照1:1将原孔内悬浮细胞转移至新孔中。补充 新鲜分化培养基至初始体积（步骤3表格）。

   8.D10：轻轻吹打细胞，收集悬浮细胞，即为分化成熟的小鼠cDC2，可进行后续操作和分析。

注：如需研究特定刺激对DC 的影响，可提前加入相应刺激，待D10收集细胞进行分析。

常见问题及提示

培养过程中，随着培养时间的延长，有越来越多的细胞出现贴壁属于正常现象，收集细胞操作时，请轻轻混匀后收取悬浮细胞进行后续分析，弃掉牢固贴壁的细胞（多为巨噬细胞）。

此系统培养出的总细胞，其中cDC2树突状细胞占总细胞比例应为80-95%范围内。

数据展示

图：小鼠CD11b+cDC2树突状细胞鉴定。取4-6周龄雄性C57BL/6小鼠按照上述说明培养CD11b+cDC2至第10天，收集悬浮细胞检测DC产生和亚群分布。